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Jun 20, 2023

Fusion de particules de super

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 13327 (2023) Citer cet article 1591 Accès à 2 détails de Altmetric Metrics La microscopie de localisation de molécule unique offre une résolution proche du

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13327 (2023) Citer cet article

1591 Accès

2 Altmétrique

Détails des métriques

La microscopie de localisation de molécules uniques offre une résolution presque jusqu'au niveau moléculaire avec un marquage moléculaire spécifique et constitue donc un outil prometteur pour la biologie structurale. En pratique, cependant, la valeur réelle de ce champ est limitée principalement par un marquage fluorescent incomplet de la structure. Ces informations manquantes peuvent être complétées en fusionnant les informations de nombreuses particules structurellement identiques dans une approche de fusion de particules similaire à l'analyse cryo-EM d'une seule particule. Dans cet article, nous présentons une analyse des résultats de fusion de particules de nucléoporines Nup96 marquées par fluorescence dans le complexe des pores nucléaires pour montrer que Nup96 se produit dans un arrangement spatial de deux anneaux de 8 unités avec deux copies de Nup96 par unité, ce qui donne un total de 32 Nup96. copies par pore. Nous utilisons la modélisation assistée par intelligence artificielle dans Alphafold pour étendre le modèle cryo-EM existant de Nup96 afin d'identifier avec précision les positions des marqueurs fluorescents et de montrer que la précision de la correspondance entre les données fluorescentes et cryo-EM est meilleure que 3 nm dans le plan. et 5 nm hors du plan.

Le complexe des pores nucléaires (NPC) est une machine moléculaire essentielle intégrée dans l'enveloppe nucléaire reliant le noyau au cytoplasme1,2,3. Le NPC agit comme une barrière de diffusion qui sépare le compartiment nucléaire du cytoplasme et sert de passerelle pour la régulation des gènes4,5. Il est indispensable dans les processus cellulaires eucaryotes tels que la régulation du transport des protéines et des ribonucléoprotéines4,6,7. La structure et la composition moléculaire du NPC, en particulier l'échafaudage, ont été largement étudiées. Des études antérieures de microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) et de tomographie cryoélectronique (cryo-ET) ont permis de résoudre la structure de l'échafaudage NPC à haute résolution1,2,3,8,9,10,11. L'échafaudage est composé de plusieurs copies d'environ 34 nucléoporines différentes (Nups) et ces Nups sont organisées en trois anneaux12,13,14. Des études antérieures ont montré que l'anneau cytoplasmique (CR) et l'anneau nucléaire (NR) sont composés de plusieurs complexes dits Y et que les protéines Nup96 sont contenues dans ces complexes Y10,15. Chaque anneau contient 16 molécules Nup96, organisées en unités présentant une symétrie de rotation octuple15,16,17.

La microscopie à super-résolution apparaît comme une technique complémentaire pour l'étude de la structure biologique, car elle offre une résolution « illimitée par diffraction »18,19,20. La microscopie de localisation de molécule unique (SMLM) est l'une de ces techniques de super-résolution et permet d'obtenir des images super-résolues avec une résolution de 10 à 20 nm en localisant des émetteurs fluorescents uniques18,21. Si de nombreuses structures chimiquement identiques, appelées particules, peuvent être imagées, elles peuvent être enregistrées et combinées en une seule « super-particule ». Avec cette stratégie, le degré souvent médiocre de marquage de chaque particule individuelle peut être atténué et des reconstructions avec une résolution encore meilleure que celle typique de 20 nm peuvent être obtenues22,23,24,25. Différentes méthodes de fusion de particules basées sur un modèle 2D ont été appliquées dans SMLM pour démontrer la symétrie de rotation octuple du NPC22,26,27. Ces méthodes comportent cependant le risque de générer des reconstructions avec un biais en faveur du modèle. Plus tard, une approche d’enregistrement 2D sans modèle pourrait révéler la symétrie octuple du PNJ de manière impartiale28. Cette méthode sans modèle a été étendue à la 3D et utilisée pour reconstruire la structure 3D de Nup107 et Nup96, révélant deux anneaux déphasés avec huit blobs par anneau . Cependant, cette approche 3D souffrait de l'artefact de « point chaud », qui ne pouvait être atténué qu'en appliquant les connaissances préalables sur la symétrie octuple lors d'une étape de post-traitement. Dans une autre approche de fusion de particules 3D, un modèle est adapté aux PNJ individuels30 et les particules sont combinées par ordre de similarité dans la super-particule. Cette approche montre également deux anneaux contenant chacun huit blobs ou clusters dans la reconstruction du PNJ, comme prévu, mais il est intéressant de noter que certains blobs sont allongés et inclinés dans le plan des anneaux. Limitées par leur coût de calcul élevé, ni l'approche de la Réf.29 ni celle de la Réf.30 ne peuvent reconstruire des milliers de particules dans un temps raisonnable. Nous avons récemment introduit une approche de fusion de particules rapide et sans modèle31 qui surmonte la limitation de la vitesse de calcul, de sorte que des ensembles de données de plusieurs milliers de particules (ou plus) soient désormais accessibles pour l'analyse structurelle. Dans notre approche itérative de fusion rapide de particules31, nous faisons pivoter et traduisons toutes les particules pour les adapter à un modèle de mélanges gaussiens (GMM) à l'aide de la méthode d'enregistrement conjoint de nuages ​​de points multiples (JRMPC)32, puis mettons à jour les positions et les largeurs des centres gaussiens. À chaque itération, les particules et le GMM sont mis à jour. En raison des limitations inhérentes à la méthode d'enregistrement conjoint, nous ne pouvons obtenir qu'un alignement localement optimal des particules constituées de plusieurs amas distincts avec des poses différentes. Nous classons ensuite33 ces particules alignées avec différentes poses et les recombinons pour obtenir une solution globalement optimale constituée d'une seule structure bien alignée.